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2019-11-05 18:40

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  PAGE — —PAGE 180 山东理工大学教案2007~ 2008学年 第 1学期 课 程 名 称 授 课 对 象 主 讲 教 师 教师所在院(部)、系(室) 选 用 教 材 学 时 / 学 分基因工程原理 孟春晓生命科学院生物技术与工程系基因工程原理48/3 生命科学学院 教案编写说明教案是任课教师的教学实施方案。任课教师应遵循专业教学计划制订的培养目标,以教学大纲为依据,在熟悉教材、了解学生的基础上,结合教学实践经验,提前编写设计好本门课程每次课的全部教学活动。教案编写说明如下:1、教学课型表示所授课程的类型,请在理论课、实验课、习题课、实践课、技能课及其它栏内选择打“√”。2、教学内容:是授课的核心。将授课的内容按章、节或主题,有序的进行设计编排,并标以“*”和“#”符号以表示重点和难点。3、教学方法和教学手段:教学方法指讲授、讨论、示教、指导等。教学手段指板书、多媒体、网络、模型、标本、挂图、音像等教学工具。4、讨论、思考题和作业:提出若干问题以供讨论,或作为课后复习时思考,亦可要求学生作为作业来完成,以供考核之用。5、参考资料:列出参考书籍、有关资料。6、首次开课的青年教师的教案应由导师审核。7、鼓励教师在教学内容、教学方法和教学手段等方面进行创新与改革。8、所有开课课程必须按此标准编写教案。 山 东 理 工 大 学 教 案 第 1 次课教学课型:理论课□ 实验课□ 习题课□ 实践课□ 技能课□ 其它□主要教学内容(注明:* 重点 # 难点 ):第一章:绪论*基因工程的基本概念:是一项将生物的某个基因通过基因载体运送到另一种生物的活性细胞中,并使其无性繁殖和行使正常功能,从而创造生物新品种或新物种的遗传学技术。(还需要掌握移动基因、断裂基因、重叠基因、假基因、重复序列、基因组等的基本概念)基因工程发展史(三大理论和技术基础):三大理论:肺炎球菌转化实验;DNA分子结构的发现及DNA半保留复制机理的阐述;遗传信息中心法则的确立。技术基础:切割目的基因片段;扩增目的基因片段;重新连接目的基因片段。基因工程的巨大意义(农业,工业,医药)生物技术与基因工程教学目的要求:初步了解基因工程这门课程的诞生背景和研究意义教学方法和教学手段:讲授和多媒体讨论、思考题、作业: 参考资料:简明基因工程原理(第二版) 贺淹才编著 科学出版社 注:教师讲稿附后教师讲稿 第一章??绪? 论在研究生物演化的过程中,遗传和变异是两个重要的概念。遗传性赋予生物种的稳定,保证生物种的延续不断。变异性赋于生物种的进化,保证生物种对各种环境的适应。在生物演变的长河中,自然发生的变异是非常缓慢的,随着生物科学的发展,人类开始学会干预生物的变异,经典遗传学的出现,使人们在几年至几十年内便可实现在自然界中需要千百万年才能出现的变异.从而改变了某些物种,有利于人类????20 世纪是生物学发展最为迅速的时期, 1953 年由于认识了 DNA 的双螺旋结构,从而揭开了分子生物学研究的热潮。在整个生物学研究进程或研究层次来说,其发展过程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平,同时由于遗传学的兴起与发展, DNA 作为生命遗传信息的物质基础被确定下来,从而导致分子生物学的诞生。分子生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上进行研究的生物学,研究生物的生物学现象和本质,如DNA的结构、复制、表达、调控、遗传、变异等。由于分子生物学的进一步发展,生物学的各个分枝学科都延伸到了分子水平,在这种情况下,传统分子生物学就是一个包罗万象的学科,大的可以说动、植、微生物的分子生物学,小的可以说某些物种的分子生物学,如水稻的分子生物学、链霉菌的分子生物学、芽胞杆菌的分子生物学。在这种情况下,传统的分子生物学就好象是高级生物化学,阐述基因或者说 DNA(核酸)的静态和动态化学本质。目前的分子生物学,朝着发育、结构和遗传生物学的方向发展。如果说传统的分子生物学是静态分子生物学的话,那么这些学科可以说是动态分子生物学,即在分子水平(核酸)上,研究生物的生长、分化、死亡以及遗传和变异的内在规律。在以上这些研究中,均涉及在 DNA 水平的操作,本门课程就是要讲述这相关的原理,为分子生物学的研究服务。通过分子生物学内在的原理,如 DNA 结构、复制、转录、表达、调控等,讲述研究方法和技术的设计原理。从本世纪70年代初,基因工程学诞生,在短短不过30年的时间内已经取得了许多激动人心的成果。它的最大特点,就是以重组DNA的技术,开辟了在短时间内改造生物遗传性的新天地。它填补了生物种属间不可逾越的鸿沟,克服了常规育种的盲目性,使人类有可能按照需要定向培育生物新品种、新类型乃至创造自然界从未有过的新生物。目前,基因工程正以新的势头迅猛发展,成为当今生物科学研究领域中最有生命力、最引人注目的前沿科学之一。??本课程就是为了讲述在核酸水平上对基因进行研究所涉及的方法、技术和策略的原理,主要是基本的、通用的原理,对于涉及到具体的学科或领域的原理不在此范围内。一.基因工程的基本概念基因工程产生以来,还没有一个统一的公认定义。一般认为基因工程是指:把体外核酸分子(无论采取什么方法从细胞中取得)组合到任何病毒、细菌质粒或其它载体系统(分子),形成遗传物质的新组合,并使之进入到原来没有这类分子的宿主体内,而能持续稳定地繁殖。或者说,它是对DNA大分子上的遗传单元(基因)进行体外操作,把不同来源的基因按照设计的蓝图,重新构成新的基因组(即重组体),再把它引入细胞中,构成具有新的遗传特性的生物。从上面定义可以看出基因工程的一个重要特征,就是强调了外源DNA分子的新组合被引入到一种新的寄主生物中进行繁殖。这种DNA分子的新组合是按照工程学的方法进行设计和操作的。这就赋于基因工程跨越天然物种屏障的能力,克服了固有的生物种间的限制,扩大和带来了定向创造新生物的可能性,这是基因工程的最大特点。基因工程问世以来,各种相关的名称相继问世。在文献中常见的有遗传工程(Genetic emgineering)、基因工程(Gene engineering),基因操作(Gene manipulation)、重组DNA技术(Recombianant DNA technique)、分子克隆(Molecular cloning)、基因克隆(Gene cloning)等,这些术语所代表的具体内容彼此具有相关性,在许多场合下被混同使用,难以严格区分。不过它们之间还是存在一定的区别的。例如,遗传工程比基因工程有更广泛的内容,凡是人工改造生物遗传性的技术如物理化学诱变、细胞融合、花粉培育、常规育种、有性杂交等,还包括基因工程在内。因此,遗传工程包括基因工程,遗传工程不等于基因工程。又如重组DNA技术,它是基因工程的核心内容,但严格地说,基因工程除上述的定义所阐明的内容以外,还应包括体外DNA突变,体内基因操作以及基因的化学合成等。总之,凡是在基因水平上操作而改变生物遗传性的技术都属于基因工程。而重组DNA技术不等于就代表基因工程。至于生物工程,它是更大范围内改造生物并生产生物产品的工程技术,是现代生物学中一切工程技术的总称,除遗传工程、基因工程外,还有酶学工程,细胞工程、发酵工程、农业工程等。??? 克隆(Clone)一词有必要加以解释。当它作为名词使用时,是指从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代,或具有相同遗传性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。当克隆作动词使用时,是指从同一祖先生产这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。因此,基因工程也可称为基因克隆或DNA分子克隆。二.基因工程发展史(一)基因工程的诞生基因工程诞生于1973年,它是数十年来无数科学家辛勤劳动的成果、智慧的结晶。从40年代开始,科学家们从理论和技术两方面为基因工程的产生奠定了坚实的基础。概括起来,从40年代到70年代初的基因工程诞生,在现代分子生物学领域理论上的三大发现及技术上的三大发明对基因工程的诞生起到了决定性的作用:1.理论上的三大发现(1)首先,40年代发现了生物的遗传物质是DNA。l934年,Avery在美国的一次学术会上首次报道了著名的肺炎球菌的转化实验结果。超越时代的科学成就,往往不容易很快被人接受,Avery的论文没有得到公认。事隔十年,这一成果才得以公开发表。事实上,Avery不仅证明DNA是生物的遗传物质,而且也证明了DNA可以把一个细菌的性状转给另一个细菌,理论意义十分重大。正如诺贝尔奖金获得者Lede- rbevg指出的,Avery的工作是现代生物科学的革命开端,也可以说是基因工程的先导。(2)50年代搞清楚了DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。1953年,Walson和Crick提出了DNA结构的双螺旋模型。对生命科学的发展,足以和达尔文学说、盂德尔定律相提并论。? (3)60年代确定了遗传信息的传递方式。确定遗传信息是以密码方式传递的,每三个核苷酸组成一个密码子,代表一个氨基酸。到了1966年,破译了64个密码子,编排了一本密码字典,叙述了中心法则。从此,千百年来神秘的遗传现象,在分子水平上得到了揭示。2.技术上的三大发明??(1)限制性核酸内切酶的发现? 从40年代到60年代,虽然从理论上已经确立了基因工程的可能性,科学家们也为基因工程设计了一幅美好的蓝图。但是,科学家们面对着庞大的双链DNA(ds DNA),尤其是真核生物,其DNA分子是相当巨大的,仍然束手无策,不能把它切成单个的基因片段。尽管那时酶学知识已得到相当的发展,但没有任何一种酶能对DNA进行有效的切割。直到1970年,Smith和wilcox在流感嗜血杆菌中分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind III,使DNA分子的切割成为可能。1972年Boyer实验室又发现了名叫EcoRI的核酸内切酶,这种酶每遇到GAATTC序列,就会将双链DNA分子切开形成DNA片段。以后,又相继发现了大量类似于EeoRI这样的限制性核酸内切酶,这就使研究者可以获得所需的DNA特殊片段,为基因工程提供了技术基础。(2)对基因工程技术的突破的另一发现是DNA连接酶的发现1967年,世界上有五个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。这种酶能够参与DNA缺口的修复。1970年,美国的Khorana实验室发现了一种叫T4 DNA连接酶,具有更高的连接活性。?(3)基因工程载体的发现科学家有了对DNA切割与连接的工具(酶),还不能完成DNA体外重组的工作。因为大多数DNA片段不具备自我复制的能力。所以,为了能够在寄主细胞中进行繁殖,必须将DNA片段连接到一种特定的、具有自我复制的DNA分子上。这种DNA分子就是基因工程载体(Vector)。基因工程的载体研究先于限制性核酸内切酶。从1946年起,Lederberg开始研究细菌的性因子~F因子,经过50和60年代,相继发现其它质粒,如抗药性因子(R因子),大肠杆菌素因子(CoE)。到1973年,Cohen将质粒作为基因工程的载体使用。具备了以上的理论与技术基础,基因工程诞生的条件已经成熟。两位科学的“助产士“——Berg和Cohen把基因工程接到了人间。.1972年,美国斯坦福大学的P.Berg领导的研究小组,在世界上第一次成功地实现了DNA体外重组。他们使用限制性内切酶EcoRI,在体外对猿猴病毒SV40的DNA和 λ 噬菌体的DNA分别进行酶切,然后再用T4DNA连接酶把两种酶切的DNA片段连接起来,结果获得了包含有SV40和λDNA重组的杂种DNA分子。(基因工程的雏形)1973年,斯坦福大学的S.Cohen等人,也成功地进行了另一个体外重组实验并实现了细菌间性状的转移。他们将大肠杆菌(E.Coli)的抗四环素(TCr)质粒PSCl01和抗新霉索(Ner)及抗磺胺(Sr)的质粒R6一3,在体外用限制性内切酶EcoRI切割,连接成新的重组质粒,然后转化到大肠杆菌中。结果在含四环素和新霉素的平板中,选出了抗四环素和抗新霉素的重组菌落这是基因工程发展史上第一次实现重组体转化成功的例子。基因工程从此诞生,这一年被定为基因工程诞生的元年。? (二)基因工程的成就基因工程是一门创造性的科学,有着惊人的发展潜力和广阔的应用前景。基因工程诞生30年来,已经带来了一批突破性的成果,有些已在人们的生产和生活中作出了重大贡献。基因工程从1977年起出现了飞跃的发展。在这一年中,遗传工程取得了一项震撼人心的重要成果。例如:(1)Itakara等使化学合成的激素抑制素基因与大肠杆菌β一半乳糖(苷)酶基因和PBR322质粒重组到一起,然后转化到大肠杆菌中,结果产生出含激素抑制素的嵌合型蛋白质,经溴化氰处理后,有活性的激素抑制素便释放出来。这是真核生物的人造基因首次在原核生物中表达,这一成果的取得大大增强了人们对遗传工程的兴趣和信心。他们用价值几美元的9升培养液生产出50毫克的生物活性物质,相当于50万头羊脑的提取量,意义非常重大。(2)1978年,Goedd.1等使化学合成的人胰岛素基因在大肠杆菌中表达,他们将人胰岛索两条肽链的基因引入到大肠轩菌,培养后大肠杆菌产生了人胰岛素的A链和B链,经二硫键连接后形成人胰岛索分子。有人估计,全世界约有六千万名糖尿病患者,用猪和牛的胰脏提取的胰岛素已经不能满足他们的需要。因此,人胰岛素基因在大肠杆菌中表达成功,使胰岛素人工大量合成成为可能,为广大的糖尿病患者带来了福音。(3)1979年,Gooddel等使人生长激素基因在大肠杆菌中表达成功。人生长激素由191个氨基酸组成,能促进几童生长,治疗侏儒症。医用人生长激素是从人尸体的脑下垂体分离获得的,来源极为有限。遗传工程菌能产生人生长激素,为这种激素开辟了广阔的来源。(4)1980年,Nagata等使干扰素基因在大肠杆菌中表达成功。干扰素具有抗病毒、抗肿瘤和调节免疫功能的作用。用遗传工程菌大量生产干扰素,获得成功,使大规模临床试验成为可能。此外,日本的科技人员使大豆的遗传基因插入大肠杆菌的质粒中,人工合成大豆蛋白获得成功。美国Abbott公司用基因工程方法使大肠杆菌产生出人体尿激酶。(5)1981年,从遗传工程菌获得的新产物有动物口蹄疫疫苗,乙型肝炎病毒表面抗原和核心抗原以及牛生长激素等。上述产物的获得,对人乙型肝炎的诊断和防治,饲养动物的口蹄疫防治以及提高牛肉牛奶的产量具有重要意义。我国乙型肝炎病毒(HBV)基因工程研究工作自1983年开始。上海生化所,中国预防医学科学院病毒所,中国医学科学院基础所,军事医学科学院以及上海生物制品所等许多单位相继开展了HBV的分子克隆和DNA全序列测定、基因定位等理论工作。军事医学科学院还用E.coli生产 HBcAg作为肝炎的诊断试剂出售。但一般来说,表达的水平都不太高。可以预料,用基因工程疫苗治疗乙肝的日子已为期不远。(三) 重组DNA技术发展史的某些重要事件三.基因工程的巨大意义工业领域:受益较早的是发酵工业和医药工业,使反应在常温常压下进行。基因工程菌的使用使细菌在发酵中的产率提高;提供原来只有动物体内才能产生的物质,如抗原、抗体和其他生物制品;大大减少原材料资源的过度浪费和工业废物的排放,可减轻环境污染。农业领域:利用基因工程技术改良甚至创造作物新品种。医学领域:基因工程技术发展成为基因诊断和基因治疗等,此外还可以包括制备有生物活性的肽类和蛋白质在医疗上的应用等,并且用基因工程技术生产生物制品,社会效益和经济效益都是可观的。四.生物技术与基因工程生物技术:是研究怎样利用生物体、生命体系或生命过程,来制造产品和造福人类社会的一门新兴技术科学。有人将微生物技术的利用分为三类,酶工程、发酵工业、酿造工业。生物工程是分子遗传学、微生物学、细胞生物学、生物化学、化学工程和加工工艺学等学科的结合,应用范围十分广泛。一般认为生物工程应包括基因工程、细胞工程、以发酵为主的微生物工程和酶工程等四大部分。基因工程和细胞工程是生物工程的基础。山 东 理 工 大 学 教 案 第 2次课教学课型:理论课□ 实验课□ 习题课□ 实践课□ 技能课□ 其它□主要教学内容(注明:* 重点 # 难点 ):第一章:绪论我国基因工程发展现状基因工程的安全性我国的《基因工程安全管理办法》*基因工程的基本过程(分、切、连、转、筛):1.目的基因的制取2.基因载体的选择与构建3.目的基因与载体DNA的拼接4.重组体分子导入受体细胞5.外源基因的表达和产物的分离纯化基因工程的上游和下游基因工程的上游工程—基因克隆*基因工程基本流程教学目的要求:初步了解基因工程原理这门课程的相关技术手段教学方法和教学手段:讲授和多媒体讨论、思考题、作业: 参考资料:简明基因工程原理(第二版) 贺淹才编著 科学出版社注:教师讲稿附后教师讲稿五.我国基因工程发展现状我国自20世纪70年代末即开始了基因工程研究工作,经过20多年的研究开发,我国的基因工程发展在医学、农业各个领域都取得了令人瞩目的成果,正逐步向产业化迈进。六.基因工程的安全性从基因工程诞生之日起,受到人类的极大关注。其理论和实践的意义都非常重大,但和任何新生事物一样,其成长过程中也遇到了强大的阻力。基因工程刚诞生的头几年,人们对它有不少争论。举几个简单的例子:1.人们担心“基因逃逸”问题,由于微生物之间通过转导、转化、接合进行基因转移。“有害”基因是否会逃逸到人体或环境中。科学家们经常使用大肠杆菌作为宿主菌。重组质粒转入大肠杆菌中表达,人们担心大肠杆菌会通过研究者的消化道带出实验室。经过连续两年对研究人员的粪便检查,均未发现大肠杆菌和质粒。2.前段时间英国“多莉”的死亡。希特勒。美国科幻电影。3.对转基因食品的安全性的问题。随着全球人口增多,粮食紧张的问题日益严重。许多生物学家致力于高产、高质的农作物。提高农作物产量的方法主要有2方面:一方面发现高产农作物(不大可能);另一方面减少农作物生长中的损失(旱、涝、病毒、虫,腐烂等)。目前,植物基因工程方面使用技术就是从其他物种上分离有效的基因,然后转移到农作物上(例如:现在已有的,抗虫棉,水稻,土豆,西红柿,大豆,玉米等)。现在产生的问题是,安全性问题。特别是人们将大量的食用转基因食品,其安全性问题应该引起高度重视和科学地评价,确保人民健康,才能使基因工程顺利发展。转基因植物食品的安全性主要包括2方面:(1)?转基因植物食品有无毒性物质及有无过敏性蛋白。(2)食品安全性中的另一个重要问题是标记基因的安全性评价。nptⅡ(新霉素磷酸转移酶基因)、hpt(潮霉素磷酸转移酶基因)、gent(乙酰转移酶基因)及抗除莠剂的基因在转基因植物中得到高表达,人们食用大量转基因食品是否可能对抗生素产生抗药性。4.基因工程与生态环境平衡转基因作物栽到大田后,会不会和野生亲缘植物自然杂交,导致野生亲缘植物获得抗性,从而影响环境。而导致产生新的杂草类型。如除草剂对已俘获了抗除草剂基因的杂草不再具备除草性能;抗虫基因的俘获也许会导致害虫种类交替进化;这些都迫使人们使用更危险的化学药物。可见转基因植物的大规模种植可能会群落带来极大的不利。群落的影响不但难以预料,甚至可能产生更严重的后果;俘获了毒蛋白基因会由于食草动物难以伤害它而加剧繁衍蔓延,稀有植物品种也许会由于竞争,同种植物的遗传多样性便会减少,昆虫群落也会受到影响。从以上例子可以看出,基因工程是个双刃剑,于是许多社会人士、政府官员、甚至科学家发出呼吁,要求制定法规,限制基因工程的研究。近年来关于转基因植物的安全性问题引起世界性的争论,众说风云,更激起各国的重视投入大量人力、物力进行科学地研究,美国国立卫生研究院(NIH)成立了一个专门委员会处理这些诉颂事宜,并于1975年制定了“通用重组DNA分子研究准则”,尽管已经对基因工程的安全防护作了许多规定,仍有不少科学家联名要求取消危险的实验。对基因工程争论的焦点是害怕基因工程创造的杂种生物会从实验室逸出,在自然界造成难以控制的危害。有害的杂种细菌或病毒与化学物质不同,它们会在自然界不断增殖,造成的危害更大。研究结果表明,从本质上讲转基因植物与常规育种是一样的。两者都是在原有的基础上对现有品种的某些性状进行修饰,或增加新性状,或者消除不良性状,最后培育出优质高产稳产和抗病、抗逆的新品种,它们的区别只是技术和方法问题。基因工程只是利用现代分子生物学进行单基因或多个基因的转化,增强了育种的目的性和可操作性I缩短了育种周期,应该说是更科学和更安全。例如在常规育种时,父母本的不良基因、甚至是有害基因都传递给下一代。基因工程育种只是把好的基因、有用的基因传递给下一代,使下一代不断优化。关于目的基因的结构与功能应该进行严格科学地研究和选择,堵截有害基因的使用就可以避免上述安全性的疑虑。七.我国的《基因工程安全管理办法》我国于1993年12月发布《基因工程安全管理办法》,在利用基因工程造福人类的同时,也高度重视基因工程的安全管理。八.基因工程的基本过程(1)从生物有机体复杂的基因组中,分离出带有目的基因的DNA片段。(2)在体外,将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上,形成重组DNA分子。??? (3)将重组DNA分子引入到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞)。(4)带有重组体的细胞扩增,获得大量的细胞繁殖群体(菌落)。(5)从大量的细胞繁殖菌落中,筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆。(6)将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步研究分析。 (7)将目的基因克隆到表达载体上,导入寄主细胞,使之在新的遗传背景下实现功能表达,产生出人类所需要的物质。九.基因工程的上游和下游很多人把基因的全过程分为上游技术和下游技术,一般把分子生物学研究技术称之为基因工程上游技术,而把生物化学研究技术和应用称为基因工程下游技术。这种划分是人为的,基因工程上、下游技术并没有严格的界限。一般把“分、切、连、转”的步骤作为上游技术,而把“筛”的过程作为下游技术。上、下游技术必须相互依存才具有生命力。我国目前在上游技术方面与发达国家差距较小,在下游技术方面则差距较大。十.基因工程的上游工程—基因克隆基因工程的上游工程主要是目的基因的制取和无性繁殖。具体的说就是从生物体的组织、器官或细胞制取目的基因,或者人工合成目的基因,使目的基因与载体的DNA拼接,使重组体分子导入受体细胞,筛选和进行无性繁殖。这个过程可以称为基因克隆。十一.基因工程的流程基因工程实验设计可以是多种多样的,具体的操作方法可灵活变动,各不相同,但基本过程大体一致。可把基因工程的全部工艺流程概括为下面的模式图。山 东 理 工 大 学 教 案 第 3 次课教学课型:理论课□ 实验课□ 习题课□ 实践课□ 技能课□ 其它□主要教学内容(注明:* 重点 # 难点 ):第二章:基因工程的工具酶工具酶的基本概念:基因工程的工具酶是应用于基因工程的各种酶的总称,包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取重组体DNA制备等程序中所需要的酶类。主要是限制性内切核酸酶和DNA连接酶,其他还有末端转移酶、单链核酸酶和反转录酶等。限制性核酸内切酶(限制与修饰,类型,#影响因素,命名,*特点与应用,限制性酶切图谱)教学目的要求:了解基因工程各种限制性核酸内切酶的基本性质,功能和用途教学方法和教学手段:讲授和多媒体讨论、思考题、作业:1、某学生在用EcoRI切割外源DNA片段时,出现了星号活性,请分析可能的原因?2、在序列5-CGAACATATGGAGT-3中含有一个6bp的Ⅱ类限制性内切核酸酶的识别序列,该位点的序列可能是什么?3、下面几种序列中你认为哪一个(哪些)最有可能是Ⅱ类酶的识别序列: GAATCG,AAATTT,GATATC, ACGGCA? 为什么?参考资料:简明基因工程原理(第二版) 贺淹才编著 科学出版社注:教师讲稿附后教师讲稿第二章??各种工具酶一.基因工程工具酶的概念工具酶的基本概念:基因工程的工具酶是应用于基因工程的各种酶的总称,包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因选取重组体DNA制备等程序中所需要的酶类。主要是限制性内切核酸酶和DNA连接酶,其他还有末端转移酶、单链核酸酶和反转录酶等。限制和修饰现象在上个世纪中期被人们所发现,到?2005?年?1?月,已经发现 4342 种限制酶和甲基化酶,其中限制酶有 3681 种。限制性内切酶有特定的识别位点和切割位点,切割后可产生平末端或粘性末端。酶切有标准的反应体系,受末端长度的影响,有位点偏爱性,在极端非标准条件下会产生星星活性。通过酶切连接可以增减酶切位点,酶切位点在基因组中的分布是不均匀的。大肠杆菌有三种甲基化酶和三种依赖于甲基化的限制系统。甲基化对限制酶切影响。基因操作常用的 DNA 聚合酶有大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ,T4、T7 DNA 聚合酶以及末端转移酶。为满足工作需要,还开发有 Klenow DNA 聚合酶,耐热 DNA 聚合酶以及反转录酶。除限制修饰酶和聚合酶以外,基因操作中还用到很多重要的酶,包括:连接酶、T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶、核酸酶、琼脂糖酶、蛋白酶、溶菌酶以及一些 DNA 结合蛋白。基因操作包括以DNA分子的切割和连接为核心的一系列步骤,需要多种具有不同功能的工具酶参与完成。以限制性内切酶(restrictionendonuclease)和DNA连接酶(1igase)为主的多种工具酶的发现和应用,为基因操作提供了十分重要的技术基础。基因的重组与分离,涉及到一系列相互关连的酶催化反应。已经知道有许多种重要的核酸酶,例如核酸内切酶、核酸外切酶,以及用信使RNA模板合成互补链DNA的反转录酶(reversetranscriptase)等,在基因克隆的实验中都有着广泛的用途。二.限制性内切核酸酶(restriction enzyme)1.限制与修饰现象早在 50 年代初,有许多学者发现了限制与修饰现象,当时称作寄主控制的专一性(host controlled specificity)。 l 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性,其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题。 l 在感染某一宿主后,再去感染其它宿主时会受到限制。说明 K 和 B 菌株中存在一种限制系统,可排除外来的 DNA 。 10-4 的存活率是由宿主修饰系统作用的结果,此时限制系统还未起作用。而在 C 菌株不能限制来自 K 和 B 菌株的 DNA 。限制作用实际就是限制酶降解外源 DNA ,维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用,可使腺嘌呤 A 成为 N6 甲基-腺膘呤,胞嘧啶 C 成为 5 甲基胞嘧啶。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。在限制修饰系统中,限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用,破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等),使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制;而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后,通过修饰酶的作用:在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰,可免遭自身限制性酶的破坏,这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。2.限制性核酸内切酶的类型目前已经鉴定出有三种不同类型的核酸内切限制酶,即I型酶、II型酶和III型酶。这三种不同类型的限制酶具有不同的特性。1968年,Meselson和Yuan最早从大肠杆菌B和K菌株的限制和修饰系统中分离到限制性内切酶,这种酶后来被命名为I型限制性核酸内切酶。I型限制性内切酶虽可识别DNA分子中特定的核苷酸序列,但它们的切割作用却是随机进行的,其切割方式是,先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互结合,然后沿着DNA移动相当于1000~5000个核苷酸的一段距离后,在似乎是随机的位置上切割一股单链,形成大约75个核苷酸的缺口。因此,I型限制性内切酶在基因操作中没有什么实际的应用价值。在1970年,发现II型酶,由于其核酸内切酶活性和甲基化作用活性是分开的,而且核酸内切作用又有序列特异性,故在基因克隆中有特别广泛的用途。所以在基因工程中我们着重介绍II型酶。3.影响核酸内切限制酶活性的因素(1) DNA的纯度核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率,在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质,例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等,都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。为了提高核酸内切酶对低纯度DNA的反应效率,一般采用如下三种方法:①增加核酸内切限制酶的用量,平均每微克底物DNA可高达10单位甚至更多些。②扩大酶催化反应的体积,以使潜在的抑制因素被相应地稀释。③延长酶催化反应的保温时间。在有些DNA制剂中,尤其是按微量碱法制备的,会含有少量的DNase的污染。由于DNase的活性需要有Mg2+的存在,而在DNA的贮存缓冲液中含有二价金属离子螯合剂EDTA,因此在这种制剂中的DNA仍然是稳定的。然而在加入了核酸内切限制酶缓冲液之后,DNA则会被DNase迅速地降解掉。要避免发生这种情况,唯一的办法就是使用高纯度的DNA。?(2) DNA的甲基化程度核酸内切限制酶是原核生物限制—修饰体系的组成部分,因此识别序列中特定核苷酸的甲基化作用,便会强烈地影响酶的活性。为避免产生这样的问题,在基因克隆中使用的是失去甲基化酶的大肠杆菌菌株制备质粒DNA。?(3)?酶切消化反应的温度DNA消化反应的温度,是影响核酸内切限制酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切限制酶,具有不同的最适反应温度,而且彼此之间有相当大的变动范围。大多数核酸内切限制酶的标准反应温度都是37℃,但也有许多例外的情况,它们要求37℃以外的其它反应温度。其中有些核酸内切限制酶的最适反应温度低于标准的37℃,例如SmaI是25℃、ApaI是30℃;有些核酸内切限制酶的最适反应温度则高于标准的37℃,例如MaeI是45℃(4)?DNA的分子结构DNA分子的不同构型对核酸内切限制酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切限制酶切割超螺旋的质粒DNA或病毒DNA所需要的酶量,要比消化线性DNA的高出许多倍,最高的可达20倍。此外,还有一些核酸内切限制酶,切割它们自己的处于不同部位的限制位点,其效率亦有明显的差别。据推测,这很可能是由于侧翼序列的核苷酸成份的差造成的。?(5)?核酸内切限制酶的缓冲液核酸内切酶的标准缓冲液的组份包括:氯化镁、氯化纳或氯化钾、Tris-HCl,?-巯基乙醇或二硫苏糖醇(DTT)以及牛血清白蛋白(BSA)等。酶活性的正常发挥,是绝对地需要二价的阳离子,通常是Mg2+。不正确的NaCl或Mg2+浓度,不仅会降低限制酶的活性,而且还可能导致识别序列特异性的改变。缓冲液Tris—HCl的作用在于使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳数值的范围之内。对绝大多数限制酶来说,在pH=7.4的条件下,其功能最佳。巯基试剂对于保持某些核酸内切限制酶的稳定性是有用的,而且还可保护其免于失活。但它同样也可能有利于潜在污染杂质的稳定性。有一部分核酸内切限制酶对于钠离子或钾离子浓度变化反应十分敏感,而另一部分核酸内切限制酶则可适应较广的离子强度的变化幅度。在“非最适的”反应条件下(包括高浓度的核酸内切限制酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+以及高pH值等等),有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”,从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子。有些核酸内切限制酶的切割特异性,受所用的缓冲液成份的影响比较明显。例如,最常用的EcoRI限制酶,在正常的情况下,是在G?? AATTC识别序列处发生切割作用的,但如果缓冲液中的甘油浓度超过5%(V/V),那么其识别序列的特异性就会发生松动,可在AATT或PuPuATPyPy序列处发生切割作用。EcoRI限制酶的这种特殊的识别能力,通常叫做星号活性,以EcoRI*表示。4.核酸内切限制酶的命名法由于发现了大量的限制酶,所以需要有一个统一的命名法。H.O.Smith和D.Nathans(1973)提议的命名系统,已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点:?1) 用属名的头一个字母和种名的头两个字母,组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如,大肠杆菌(Escherichia? coli)用Eco表示,流感嗜血菌(Haemophilus? influen—zae)用Hin表示。2) 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型,例如Ecok。如果限制与修饰体系在遗传上是由病毒或质粒引起的,则在缩写的寄主菌的种名右下方附加一个标注字母,表示此染色体外成分。例如Ecop1,EcoR1。3) 如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示。因此,流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。?4) 所有的限制酶,除了总的名称核酸内切限制酶R外,还带有系统的名称,例如核酸内切酶R.HindIII。同样地,修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内切酶R.HindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶,命名为甲基化酶M. HindIII。??在实际应用上,这个命名体系已经作了进一步的简化:??①由于附有标注字母在印刷上很不方便,所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。?②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方,核酸内切酶的名称R便被省去。同裂酶 (isoschizomers)有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列,这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。同裂酶产生同样的切割,形成同样的末端。例如,限制酶HpaⅡ和MspI是一对同裂酶,共同的靶子序列是CCGG。识别相同序列的限制酶称同裂酶,但它们的切割位点可能不同。具体可分为以下几种情况。① 同序同切酶 这些酶识别序列和切割位置都相同,如 HindⅡ 与 HincⅡ 识别切割位点为 GTY↓RAC , HpaⅡ 与 HapⅡ 识别切割位点为 C↓CGG , MobⅠ 与 Sau3AⅠ 识别切割位点为 ↓GATC 。② 同序异切酶 KpnⅠ 和 Acc65Ⅰ 识别的序列是相同的,但它们的切割位点不同,分别为 GGTAC↓C 和 G↓GTACC 。另外, Asp718Ⅰ 识别和切割位点为 G↓GTACC 。③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如 EcoRⅠ 识别和切割位点为 G↓AATTC , ApoⅠ 识别和切割位点为 R↓AATTY ,后者可识别前者的序列。另外, HpaⅠ 和 HincⅡ 的识别位点也有交叉,它们的识别和切割位点分别为 GTT↓AAC 和 HincⅡ 。④ 其它有些限制酶识别的序列有交叉,如在 pUC 系列质粒的多克隆位点中有一个 SalⅠ 位点(识别切割位点为 G↓TCGAC),该位点也可被 AccⅠ(识别切割位点为 GT↓MKAC)和 HincⅡ(识别切割位点为 GTY↓RAC)切割。同尾酶? (isocaudamer)与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同,识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。常用的BamH I,Bcl I,Bgl II,Xho I就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端,很显然,由同尾酶所产生的DNA片段,是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的,因此在基因克隆实验中很有用处。由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点,特称之为“杂种位点”(hybrid site)。但必须指出,这类杂种位点的结构,一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如:Sal I(5`-G ??TCGAC-3`)和Xho I(5`-C ?TCGAG-3`)的消化片段相连,但所形成的重组片段(5`-GTCGAG-3`)则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外。星星活性(star activity)在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特殊性称星星活性。实际上星星活性是限制性内切酶的一般性质,任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点,如 ApoⅠ、AseⅠ、BamHⅠ、BssH11、EcoRⅠ、EcoRV、HindⅢ、HinfⅠ、KpnⅠ、PstⅠ、PvuⅡ、SalⅠ、ScaⅠ、TaqⅠ 和 XmnⅠ 等酶皆可表现出星星活性。星星活性在绝大多数情况下是可控制的。限制酶的特异性变化方式与酶的种类和所用的条件有关,最普遍的活性变化来自 1 个碱基的变化、识别位点外层碱基的随意性,以及单链缺口。引起星星活性的因素有甘油浓度高(5%),酶过量(100U/ml),离子强度低(25mM), pH 值过高(8.0),或是加了有机溶剂如 PMSD (二甲基亚砜)、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺(dimethylacetamide)、二甲基甲酰胺(dimethbylformamide)、 sulphalane 等等,或是用其它二价阳离子如 Mn++ 、Cu++、Co++ 或 Zn++ 代替了 Mg++ 。但不同的酶对上述条件的敏感性不一样,如 PstⅠ 比 EcoRⅠ 对高 pH 更敏感,但后者对甘油浓度更敏感。抑制星星活性的措施有许多,如减少酶的用量(可避免过份酶切),减少甘油浓度,保证反应体系中无有机溶剂或乙醇,提高离子强度到 100~150mM (如果不会抑制酶的活性的话),降低反应 pH 至 pH7.0 ,以及保证使用 Mg++ 作为二价阳离子。5.作用特点与应用特点:1)识别位点的DNA序列具有回文结构2)切割DNA均产生含5-磷酸和3-羟基的末端3)错位切割产生具有5-或 3-突出的黏端;而沿对称轴切割双链DNA产生平端4)少数不同的限制酶可识别和切割相同的位点,在一定条件下可选择用这些酶同尾酶用途:1)在特异位点上切割DNA,产生特异的限制酶片段2)建立DNA分子的限制酶图谱3)构建基因文库4)用限制酶切出的相同的黏性末端,以便重组6.DNA的限制酶分析及物理图谱限制性酶切图谱指一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上出现频率和它们之间的相对位置。绘制DNA物理图谱的主要工作是酶解DNA及对酶解产物的分析,包括准确统计切点的数目,计算酶解产物的相对分子质量和确定各DNA片段的相对位置等。山 东 理 工 大 学 教 案 第 4 次课教学课型:理论课□ 实验课□ 习题课□ 实践课□ 技能课□ 其它□主要教学内容(注明:* 重点 # 难点 ):DNA聚合酶(*大肠杆菌DNA聚合酶I,# klenow聚合酶,T4 DNA聚合酶,*Taq 酶,*反转录酶等的性质和应用):分子克隆操作中,常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I,大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段,T4DNA聚台酶,T7DNA聚合酶,逆转录酶等。这些DNA聚合酶的共同特点是,它们都能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3,一OH末端,催化核苷酸的聚合,而不发生从引物模板上解离的情况。其中,T7DNA聚合酶的聚合能力最强。DNA连接酶(*性质,作用机制,分类,*应用):同核酸内切限制酶一样,DNA连接酶的发现与应用,对于重组DNA技术学的创立与发展也具有头等重要的意义。它们都是在体外构建重组DNA分子所必不可少的基本工具酶。核酸内切限制酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段,然而要将不同来源的DNA片段组成新的杂种DNA分子,还必须将它们彼此连接并封闭起来,这就需要DNA连接酶发挥作用。教学目的要求:了解基因工程DNA连接酶和DNA聚合酶的性质和应用教学方法和教学手段:讲授和多媒体讨论、思考题、作业:怎样将一个平末端DNA片段插入到EcoR I限制位点中去? 参考资料:简明基因工程原理(第二版) 贺淹才编著 科学出版社注:教师讲稿附后教师讲稿三.DNA聚合酶分子克隆操作中,常使用的DNA聚合酶有大肠杆菌DNA聚合酶I,大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow大片段,T4DNA聚台酶,T7DNA聚合酶,逆转录酶等。这些DNA聚合酶的共同特点是,它们都能把脱氧核糖核苷酸连续加到双链DNA分子引物链的3一OH末端,催化核苷酸的聚合,而不发生从引物模板上解离的情况。其中,T7DNA聚合酶的聚合能力最强。1.大肠杆菌DNA聚合酶I? 1956年A.Kornberg等首先从E.co1i细胞中分离出来。它是在DNA模板的方向上催化核苷酸聚合的酶,由单一多肽组成球蛋白。1.1功能:DNA聚合酶I是一个多功能酶,它包括三种不同的酶活力:(1) 5’3,聚合酶活性: 催化单核苷酸结合到DNA模板的3,一OH末端,以ssDNA作模板,沿引物的3,一OH方向按模板顺序从5,一3’延伸。(2) 5, 3,外切酶活性:E.co1i DNA 聚合酶1也能从游离的5,末端降解dsDNA成为单核苷酸。(3) 3, 5,外切酶活性:DNA聚合酶I还能从游离的3,OH末端降解dsDNA或ssDNA成为单核苷酸。1.2大肠杆菌DNA聚合酶在基因工程中的重要用途:DNA聚合酶I在分子克隆中的主要用途是,通过DNA缺口转移,制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。缺口转移(nicktranslation)指在DNA分子的单链缺口上,DNA聚合酶I的5’3,核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。这就是说,当外切酶活性从缺口的5,一侧移去一个核苷酸之后,聚合作用就会在缺口的3,一侧补上一个新的核苷酸。但由于PolI不能够在3,—OH和5,—P之间形成一个键,因此随着反应的进行,5,一侧的核苷酸不断地被移去,3,一侧的核苷酸又按序地增补,于是缺口便沿着DNA分子按合成的方向移动。这种移动特称为缺口转移(nicktranslation)(图)。在迄今已发现的所有大肠杆菌聚合酶中,唯有Poll能够进行这种独立的链的取代反应。在下面我们就可以看到,这对于重组DNA技术学来说的确是十分重要的。DNA杂交探针的制备带放射性同位素标记的DNA杂交探针,在基因分离和操作中都经常要用到。应用缺口转移法制备DNA杂交探针。其典型的反应体系是,在25u1总体积中含有1ug纯化的特定的DNA片段,并加入适量的DNaseI、Pol I、a-32P-dNTPs和未标记的dNTPs。其中,DNaseI的作用在于给DNA分子造成断裂或缺口,随后Poll则作用于这些单链缺口进行缺口转移,使反应混合物中的32p标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸,并最终形成从头到尾都被标记的DNA分子。2.Klenow聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段,又叫做Klenow聚合酶。?Klenow DNA 聚合酶是i DNA polymerase Ⅰ 经蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)裂解而从全酶中除去 5--3 外切活性的肽段后的大片段肽段,而5--3聚合活性和 3--5 外切活性不受影响,也称为 Klenow 片段(Klenow fragment),或 E.coli DNA 聚合酶 Ⅰ 大片段(E.coli DNA polymerase Ⅰ large fragment)。它也可以通过基因工程得到,分子量为 76kDa 。Klenow聚合酶仍具有5,3,的聚合活性和3,5,的核酸外切酶活性,但失去了全酶的5,3,的核酸外切酶活性。在DNA分子克隆中,Klenow聚合酶的主要用途:标记DNA末端。1) 补平 3 凹端 DNA 。使用单纯的 DNA 合成活性。注意要加足够的 dNTP ;如果使用带标记的 dNTP ,则可对 DNA 进行末端标记。2) 抹平 DNA 3 凸端。在 3--5 外切活性作用下,可切除突出的 3 凸端。注意必须加足量 dNTP ,否则外切活性不会停止。但由于 T4 和 T7 DNA 聚合酶具更强的 3--5 外切活性,现在已经取代了 Klenow DNA 聚合酶的这一作用。3) 通过置换反应对 DNA 进行末端标记。但是该作用也已经被 T4 或 T7 DNA 聚合酶代替;它还可以在补平 3 凹端的过程中进行标记。4) 在 cDNA 克隆中合成第二链。5) 随机引物标记。6) 应用于 Sanger 双脱氧链末端终止法的 DNA 测序(已经被 T7 DNA 聚合酶取代)。7) 应用于 PCR 反应,现在已经被 Taq DNA 聚合酶等取代。8) 在体外诱变中,用于从单链模板合成双链 DNA 。选用具有3,隐蔽末端的DNA片段作放射性末端标记最为有效。样品置25oC下一道温育约1小时,即可完成DNA末端标记。因为待标记的DNA已经用适当的限制酶作了酶切消化,所形成的大小不等的DNA片段群体,它们都只是在末端被标记上,根据它们在分子量上的差别,便可以将这些片段分离出来。用Klenow聚合酶标记的DNA片段,可以作为用凝胶电泳法测定分子大小的标记样品。其根据在于被标记的DNA片段是同它们的摩尔浓度成比例,而同它们的分子大小无关。所以在限制酶消化过程所产生的大小DNA片段都得到了同等程度的标记。据此,我们便可以应用放射自显影法,来确定那些难以被溴化乙锭染色法显现的微小DNA片段的位置。3.T4 DNA聚合酶T4DNA聚合酶,是从T4噬菌体感染的大肠杆菌培养物中纯化出来的一种特殊的DNA聚合酶。具有两种酶催活性,即5,3,的聚合酶活性和3,5,的核酸外切酶活性。如同大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段一样,T4DNA聚合酶也可以用来标记DNA平末端或隐蔽的3,—末端。在没有脱氧核苷三磷酸存在的条件下,3,外切酶活性便是T4DNA聚合酶的独特功能。此时它作用于双链DNA片段,并按3,5,的方向从3,—OH末端开始降解DNA。如果反应混合物中只有一种dNTP,那么这种降解作用进行到暴露出同反应物中唯一的dNTP互补的核苷酸时就会停止。这种降解速率的限制,使得DNA核苷酸的删除受到控制,从而产生出具有一定长度的3,—隐蔽末端的DNA片段。于是,当反应物中加入标记的脱氧核苷三磷酸(a-32p-dNTPs)之后,这种局部消化的DNA片段便起到了一种引物——模板的作用。T4DNA聚合酶的聚合作用速率超过了外切作用的速率,因此出现了DNA净合成反应,重新合成了完整的具有标记末端的DNA分子。由于在这种反应中,通过T4DNA聚合作用,反应物中的a-32P-dNTP逐渐地取代了被外切活性删除掉的DNA片段上的原有的核苷酸,因此特称为取代合成。应用取代合成法可以给平末端的DNA片段或具有3,—隐蔽末端的DNA片段作末端标记。4.耐热 DNA 聚合酶耐热 DNA 聚合酶在高温下有 DNA 聚合活性,来自噬高温的细菌,主要用于 PCR 反应,如 Taq DNA 聚合酶、 Vent DNA 聚合酶、 Pfu DNA 聚合酶、 Pwo DNA 聚合酶和 Tth DNA 聚合酶等。其性质详见 PCR 一章。5.逆转录酶反转录酶即依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶,它有 5--3 合成 DNA 活性,但是无 3--5 外切活性。它来自 AMV (禽成髓细胞瘤病毒)或 Mo-MLV (Moloney 鼠白血病病毒,又称 M-MuLV)。AMV 反转录酶包含两条多肽链,具 5--3 DNA 聚合活性和很强的 RNA 酶 H 活性。在 cDNA 合成开始时,引物和 mRNA 模板杂交体可成为 RNase H 的底物,此时,模板的降解和 cDNA 的合成相竞争;反应终止时, RNase H 可在正在增长的 DNA 链近 3 端切割模板,趋向于抑制 cDNA 的产量并限制其长度。在 42℃ (鸡的正常体温)能有效发挥作用,能有效地拷贝较复杂的 mRNA ,但提纯过程中易被内切酶污染。????M-MuLV 反转录酶是单链多肽, 84kDa ,其 RNase H 活性弱,有利于合成较长 cDNA。其基因工程产品纯度高。逆转录酶也是一个多功能性酶,主要有几种不同的酶活性:(1)?RNA依赖的DNA聚合酶 ?以RNA链为模板, 以带3,一OH末端的DNA片段为引物,沿5,3,方向合成DNA链。(2)?DNA依赖的DNA聚合酶? 以ssDNA为模板,以带有3’一OH末端的DNA片段为引物,从5’3’方向合成DNA链。(3)?外切RNA酶活性? 底物是RNA—DNA杂交分子中的RNA链,有两种活性形式。从RNA链5’末端外切的称5’3’外切RNA酶,从RNA链3’末端外切的称3,5,外切RNA酶H。??? 。在基因工程中,逆转录酶的主要用途是转录mRNA成为cDNA制备基因片段。另外,它也可用ssDNA或RNA做模板制作制备,杂交探针。四.DNA连接酶同核酸内切限制酶一样,DNA连接酶的发现与应用,对于重组DNA技术学的创立与发展也具有头等重要的意义。它们都是在体外构建重组DNA分子所必不可少的基本工具酶。核酸内切限制酶可以将DNA分子切割成不同大小的片段,然而要将不同来源的DNA片段组成新的杂种DNA分子,还必须将它们彼此连接并封闭起来。目前已知有三种方法可以在体外连接DNA片段:1)用DNA连接酶连接具有互补粘性末端的DNA片段;2)用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连接起来,或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)—poly(dT)尾巴之后,再用DNA连接酶将它们连接起来;3)DNA片段末端加上化学合成的衔接物或接头,使之形成粘性末端之后,再用DNA连接酶将它们连接起来。这三种方法虽然互有差异,但共同的一点都是利用DNA连接酶所具有的连接和封闭单链DNA的功能。1.DNA连接酶的发现1967年,世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶,即DNA连接酶(1igase)。这种酶需要在一条DNA链的3,—末端具有一个游离的羟基(—OH),和在另一条DNA链的5,—末端具有一个磷酸基团(—P),只有在这种情况下,才能发挥其连接DNA分子的功能作用(图)。同时,由于在羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种吸能的反应,因此还需要有一种能源分子的存在才能实现这种连接反应。在大肠杆菌及其它细菌中,DNA连接酶催化的连接反应,是利用NAD+[烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(氧化型)]作能源的;而在动物细胞及噬菌体中,则是利用ATP[腺苷三磷酸]作能源。?值得注意的一点是,DNA连接酶并不能够连接两条单链的DNA分子或环化的单链DNA分子,被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分。实际上,DNA连接酶是封闭双螺旋DNA骨架上的缺口(nick),即在双链DNA的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂;而不能封闭裂口(gap),即在双链DNA的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链断裂。2.DNA连接酶的连接机理在反应中,ATP(在有些连接酶是NAD)提供了激活的AMP,同DNA连接酶生成一种共价结合的酶-AMP复合物,同时伴随着释放出焦磷酸(PPi)或烟酰胺单核苷酸(NMN)。其中,AMP(腺苷一磷酸)是通过一种磷酸酰胺键同DNA连接酶的赖氨酸之c—氨基相连(图)。激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5,—末端磷酸基团上,形成DNA—腺苷酸复合物。最后一步是3,—OH对活跃的磷原于作亲核攻击,结果形成磷酸二酯键,同时释放出AMP。这个反应序列,是由在DNA连接酶—腺苷酸复合物形成过程中,释放出来的焦磷酸的水解作用所激发的。因此,如果是以ATP作能源的话,在DNA骨架上形成一个磷酸二酯键就要花费2个高能磷酸键。而如果是应用NAD+作为腺苷酸的给体,那么每形成一个磷酸二酯键同样也需要花费2个高能磷酸键。?? 3.分类与应用用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源:一种是由大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶:另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。这两种DNA连接酶,除了前者用NAD+作能源辅助因子,后者用ATP作能源辅助因子外,其它的作用机理并没有什么差别。T4 DNA连接酶是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中纯化的,比较容易制备,而且还能够将由限制酶切割产生的完全碱基配对的平末端DNA片段连接起来,因此在分子生物学研究及基因克隆中都有广泛的用途。连接酶连接缺口DNA的最佳反应温度是37℃。但是在这个温度下,粘性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此,连接粘性末端的最佳温度,应是界于酶作用速率和末端结合速率之间,一般认为11-16℃比较合适.1)T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase) ???T4 DNA 连接酶的分子量为 68kDa ,催化 DNA 5 磷酸基与 3 羟基之间形成磷酸二酯键。反应底物为粘端、切口、平端的 RNA (但效率低)或 DNA 。低浓度的聚乙二醇 PEG (一般为 10%)和单价阳离子(150-200mM NaCl)可以提高平端连接速率。一般采用 Weiss 单位来衡量 T4 DNA 连接酶的活性。在 37℃ 下 20 分钟催化 1 nmol 32p 从焦磷酸根置换到[g,b 32P]ATP 所需的酶量,定义为 1 个 Weiss 单位。该定义方法基于 ATP 和焦磷酸的交换,是最常用的连接酶单位,但该定义所展示的直观生物学意义不显著。 New England Biolabs 公司也提出了一种定义方式,通过粘性末端的连接效率来表示。即,在 20μl 反应体系中于 16℃ ,使 HindⅢ 切过的 l DNA (300μg/ml,0.12μM 5 末端)在 30 分钟内连接 50% 所需的酶量为 1 个 NEB 单位。 1 NEB 单位等于 0.015 Weiss 单位, 1 Weiss 单位等于 67 NEB 单位。连接反应条件需要 ATP ,若在 16℃ 反应,大约需 4 小时;若在 4℃ 反应,则需反应过夜。2)E.coli DNA 连接酶(E.coli DNA ligase)与 T4 DNA ligase 活性相似,但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸(NAD+)参与,且其平端连接效率低,常用于置换合成法合成 cDNA (见 cDNA 克隆)。作 cDNA 克隆时,不会将 RNA 连接到 DNA ,不连接 RNA 。可用于 Okayama and Berg 法克隆 cDNA 。3)Taq DNA 连接酶Taq DNA 连接酶可在两个寡核苷酸之间进行连接反应,同时必须与另一 DNA 链形成杂交体,相当于连接 dsDNA 中的缺口,作用在 45℃~65℃ ,需 NAD+ 。可用于检测等位基因的变化以及在 PCR 扩增中引入寡核苷酸。它不可替代 T4 DNA ligase 。4)T4 RNA 连接酶T4 RNA 连接酶可以催化单链 DNA 或 RNA 的 5-磷酸与另一单链 DNA 或 RNA 的 3 羟基之间形成共价连接。在单链 DNA 或单链 RNA 的 5 端磷酸基团加上可连接带 3 羟基的 DNA 或 RNA 或单核苷酸 pNp ,因此 T4 RNA 连接酶可用于标记 RNA 的 3 末端、单链 DNA 或 RNA 的连接、增强 T4 DNA 连接酶的连接活性以及合成寡核苷酸。山 东 理 工 大 学 教 案 第 5次课教学课型:理论课□ 实验课□ 习题课□ 实践课□ 技能课□ 其它□主要教学内容(注明:* 重点 # 难点 ):核酸酶(*S1核酸酶,Bal 31核酸酶,*末端转移酶等的性质和应用)Sl 核酸酶来源于米曲霉(Aspergillus oryzae),可降解单链 DNA 或 RNA ,是一种单链核酸酶。产生带 5 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链,对 dsDNA、 dsRNA 和 DNA:RNA 杂交体不敏感。酶浓度大时可完全消化双链,中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。核酸修饰酶(*碱性磷酸酶,*T4多聚核苷酸激酶等的性质和应用)T4 多核苷酸激酶是一种磷酸化酶,可将 ATP 的 g-磷酸基转移至 DNA 或 RNA 的 5 末端。在分子克隆应用中呈现两种反应,其一是正反应,指将 ATP 的 g-磷酸基团转移到无磷酸的 DNA 5 端,用于对缺乏 5-磷酸的 DNA 进行磷酸化。其二是交换反应,在过量 ATP 存在的情况下,该激酶可将磷酸化的 5 端磷酸转移给 ADP ,然后 DNA 从 ATP 中 g-磷酸而重新磷酸化。分子克隆中使用的磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase),简称 CIP 或 CIAP ,也有来自细菌的碱性磷酸酶(Bacterial alkaline phosphatase, BAP)和虾的碱性磷酸酶(Shrimp alkaline phosphatase, SAP)。它们均能催化除去 DNA 或 RNA 5 磷酸的反应。教学目的要求:了解几种重要核酸酶和核酸修饰酶的性质和应用。教学方法和教学手段:讲授和多媒体讨论、思考题、作业:用EcoRI和Hind Ⅲ分别切割同一来源的染色体DNA,并进行克隆,在前者的克隆中筛选到A基因,但在后者的克隆中未筛选到A基因,请说明原因。 参考资料:简明基因工程原理(第二版) 贺淹才编著 科学出版社注:教师讲稿附后教师讲稿五.核酸酶 (nuclease)1.BAL31 核酸酶(BAL31 nuclease)BAL31 核酸酶来源于交替单胞菌(Alteromonas espejiana)BAL31 ,主要活性为 3 外切核酸酶活性,可从线性 DNA 两条链的 3 端迅速去除单核苷酸,随后可从单链 DNA 内部发挥缓慢的内切酶活性,形成截短了的平端双链 DNA 分子(约占 10-20%)以及带有约 5 个核苷酸突出单链的截短分子(约占 80-90%)。对于所形成的单链突出,可用 DNA 聚合酶补平。酶活性发挥均匀,且酶浓度成线性关系,反应时依赖 Ca++ ,而且 EGTA 可抑制其活性。该酶可用来从两头缩短 DNA ,用于构建嵌套缺失体(见 DNA 诱变一章),也可用来制作 DNA 限制酶切图,确定 DNA 二级结构和从单链 RNA 上去除核苷酸。2.Sl 核酸酶(S1 nuclease)Sl 核酸酶来源于米曲霉(Aspergillus oryzae),可降解单链 DNA 或 RNA ,是一种单链核酸酶。产生带 5 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链,对 dsDNA、 dsRNA 和 DNA:RNA 杂交体不敏感。酶浓度大时可完全消化双链,中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。该酶可用于分析 DNA:RNA 杂交体的结构,去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端,打开双链 cDNA 合成中产生的发荚环。3.绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)绿豆核酸酶来源于绿豆芽,与 Sl 酶相似,但比 Sl 酶更温和。在大切口上才切割,更容易使双链DNA突出端变成平端。4.核糖核酸酶 A (Ribonuclease A 或 RNase A)核糖核酸酶 A 来源于牛胰,为内切核酸酶,可特异攻击 RNA 上嘧啶残基的 3 端。可除去 DNA:RNA 中未杂交的 RNA 区,可用来确定 DNA 或 RNA 中单碱基突变的位置。广泛用来去除 DNA 样品中的 RNA 。核糖核酸酶 A 商品制剂可能会污染其它酶(如 DNA 酶),使用前应加热使 DNA 酶失活。5.脱氧核糖核酸酶 Ⅰ (DNase Ⅰ)DNase Ⅰ 来源于牛胰,是内切核酸酶,可优先从嘧啶核苷酸的位置水解双链或单链 DNA 。在 Mg2+ 存在下,独立作用于每条 DNA 链,且切割位点随机。在 Mn2+ 存在下,它可在两条链的大致同一位置切割 dsDNA ,产生平端或 1-2 个核苷酸突出的 DNA 片段。DNase Ⅰ 用途广泛,如切口平移标记时在 dsDNA 上随机产生切口;在闭环 DNA 上引入单切口,以将分子截短(在亚硫酸氧盐介导的诱变前);建立随机缺失的嵌套缺失体,用于功能分析或测序;在 DNA 酶足迹法(DNA footprinting)中分析蛋白:DNA 复合物;除去 RNA 样品中的 DNA 。6.外切核酸酶 Ⅲ(Exonulease Ⅲ)大肠杆菌外切核酸酶 Ⅲ 催化从 dsDNA 3-OH 逐一去除单核苷酸的反应,底物为 dsDNA 或线状和带切口或缺口的环状 DNA ,反应结果是在 dsDNA 上产生长长的单链区。该酶还有对无嘌呤 DNA 特异性内切核酸酶活性、 RNase H 活性和 3-磷酸酶活性(去磷酸)。但不降解核酸内的磷酸二酯键,也不降解单链 DNA 及带 3 突出的 dsDNA 。该酶持续作用能力不强,产物为切割程度不相上下的群体,有利于分离长短不等的 DNA 。7.核糖核酸酶 H(Ribonuclease H 或 RNase H)核糖核酸酶 H 是内切核酸酶,特异性水解与 DNA 杂交的 RNA 上的磷酸二酯键,产生带有 3-OH 和 5 磷酸末端的产物,不降解单链核酸、 dsDNA 或 dsRNA 。许多酶附带有该酶的活性,如 AMV 反转录酶。主要用于在 cDNA 克隆合成第二链之前去除 RNA ;在脱氧核苷酸指导下在特异位点切割 RNA ;分析体外多聚腺嘌呤反应的产物,在与 Oligo(T)或 poly(dT)杂交后去掉 poly(A)尾,从而在电泳中产生清晰的条带(shaper Band)。8.RNase OneTMRNase OneTM 为 Promega 公司开发的核酸酶,分子量为 27kDa ,它可以降解 RNA 至小分子以至核苷酸,是唯一可在所有 4 个碱基处切割磷酸二酯键的酶。由于可来自基因工程产品,无其它 DNA 切割活性,使用前无需预处理。六.核酸修饰酶 1.碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)???分子克隆中使用的磷酸酶主要来源于牛小肠碱性磷酸酶(Calf intestinal alkaline phosphatase),简称 CIP 或 CIAP ,也有来自细菌的碱性磷酸酶(Bacterial alkaline phosphatase, BAP)和虾的碱性磷酸酶(Shrimp alkaline phosphatase, SAP)。它们均能催化除去 DNA 或 RNA 5 磷酸的反应。通过去除 5 磷酸基团,可用于防止 DNA 片段自身连接,或标记(5 端)前除 DNA 或 RNA 5 磷酸。 CIAP 可用蛋白酶 K 消化灭活,或在 5mM EDTA 下, 65℃ 处理或 75℃ 处理 10 分钟,然后用酚氯仿抽提,纯化去磷酸化的 DNA ,从而去除 CIAP 的活性。与 CIAP 不同, SAP 在 65℃ 处理 15 分钟后完全并不可逆地失去活性,因此在去除残留活性方面 SAP 2.T4 多核苷酸激酶 (T4 polynucleotide kinase)??T4 多核苷酸激酶是一种磷酸化酶,可将 ATP 的 g-磷酸基转移至 DNA 或 RNA 的 5 末端。在分子克隆应用中呈现两种反应,其一是正反应,指将 ATP 的 g-磷酸基团转移到无磷酸的 DNA 5 端,用于对缺乏 5-磷酸的 DNA 进行磷酸化。其二是交换反应,在过量 ATP 存在的情况下,该激酶可将磷酸化的 5 端磷酸转移给 ADP ,然后 DNA 从 ATP 中 g-磷酸而重新磷酸化。在这两个反应中如果使用的 ATP 均为放射性同位素标记[γ-32p]ATP ,那么反应的产物都变成末端获得放射性标记的 DNA 。该酶主要用于对缺乏 5-磷酸的 DNA 或合成接头进行磷酸化,同时可对末端进行标记。通过交换反应标记 DNA 的 5 末端,可供 Maxam-Gilbert 法测序、 Sl 核酸酶分析以及其它须使用末端标记 DNA 的提供材料。此酶在高浓度 ATP 时发挥最佳活性, NH4+ 是其强烈抑制剂。七.核酸酶抑制剂(RNase inhibitor)常用的核酸酶抑制剂都是生物源的, Promega 公司开发的 RNasin Ribonuclease Inhibitor 来自人类胎盘,分子量为 50kDa ; Pharmacia 公司开发的产品成为 RNA guard Ribonuclease Inhibitor ,来自人类胎盘和猪肝。核酸酶抑制剂为 RNase 的非竞争性抑制剂,以非共价方式结合在 RNase A 类的酶上,其活性需要 DTT(二硫苏糖醇)。它抑制的 RNase 包括 RNaseA、 RNase B 和 RNase C 等,不抑制 RNase H、 RNase T1、 RNase OneTM 和 Sl Nuclease 等核酸酶,也不抑制 T7、 T3 和 SP6 RNA 聚合酶,以及 AMV 和 Mu-MLV 反转录酶和 Taq DNA 聚合酶。主要用于 cDNA 合成的反应中,如反转录、 RT-PCR、体外转录和体外翻译。八、琼脂糖酶(Agarase)琼脂糖酶是一种琼脂糖水解酶,可将琼脂糖亚单位(新琼脂二糖 neoagarobiose)水解为新琼脂寡糖(neoagarooligosaccharide),用于从低溶点琼脂糖凝胶中分离纯化大片段 DNA 或 RNA 片段。该酶对热很稳定,反应时不需要缓冲液。九.DNA结合蛋白(DNA binding protein)1.单链 DNA 结合蛋白(Single strand binding protein, SSB)目前研究的比较详细的单链 DNA 结合蛋白有两种,分别来自 E.coli 和 T4 噬菌体基因 32 。此蛋白能协同地与 ssDNA 结合而不与 dsDNA 结合,可以削弱链内二级结构的稳定性,从而加速互补多核苷酸的重新退火,并通过消除阻碍 DNA 聚合酶前进的链内二级结构,而提高这些聚合酶的持续作用能力。主要用于 DNA 的电镜观察,即更好地区分单链和双链;增强 DNA 聚合酶合成长链产物;单链 DNA 结合蛋白和 RecA 蛋白并用,可进行 D 环法定点诱变;在 DNA 测序反应中,特定 SSB 可刺激特定 DNA 聚合酶的活性。2.RecA 蛋白质 (RecA protein)?RecA 蛋白质来自 E.coli ,分子量为 37.8kDa ,由 recA 基因编码。其用途与重组有关。 RecA 可与单链 DNA 结合,还可促进 dsDNA 对同源 ssDNA 的吸收作用,是一个依赖于 DNA 的 ATP 酶。可用于通过电镜分析 DNA 结构;利用 D 环法对 DNA 进行体外诱变;通过 D 环法,从 dsDNA 文库中筛选特定序列。3.拓扑异构酶 Ⅰ (Topoisomerase Ⅰ)常用的拓扑异构酶 Ⅰ 来自小牛胸腺等,通过瞬时破坏并再生磷酸二酯键,解除共价闭环 dsDNA 中的超螺旋。对 DNA 的超螺旋度相对不敏感,在 EDTA 下仍有活性。与原核 Ⅰ 型拓扑异构酶的不同之处在于,它可使正超螺及负超螺旋 DNA 完全松弛。最近,来自痘苗病毒(Vaccinia virus)的拓扑异构酶 Ⅰ 开发成试剂盒用于 PCR 产物的克隆。详见 PCR 技术原理。十.其它酶1.甲基化酶(Methylase)1)甲基化酶的种类原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员,用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。在 E.coli 中,大多数都有三个位点特异性的 DNA 甲基化酶。(1).Dam 甲基化酶Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。一些限制酶(PvuⅡ, BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、 Sau3AⅠ)的识别位点中含 GATC 序列,另一些酶 ClaⅠ(1/4)、 XbaⅠ(1/16)、TaqⅠ(1/16)、MboⅠ(1/16)、 HphⅠ(1/16) 的部分识别序列含此序列,如平均 4 个 ClaⅠ 位点(ATCGATN)中就有一个该序列。有些限制酶对 Dam 甲基化的 DNA 敏感,不能切割相应的序列,如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等。对甲基化不敏感的有 BamHⅠ、 Sau3AⅠ、 BglⅡ、 PvuⅠ 等。 MboⅠ 和 Sau3AⅠ 识别和切割位点相同,但其差异就在于前者对甲基化敏感。一般哺乳动物 DNA 不会在腺嘌呤 N6 上甲基化,因此对甲基化敏感的限制酶切割这些 DNA 不会受到影响。当需要在这些敏感位点上完全切割 DNA 时,可利用 dam- E.coli 扩增并提取 DNA 。(2).Dcm 甲基化酶Dcm 甲基化酶识别 CCAGG 或 CCTGG 序列,在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受 Dcm 甲基化作用影响的酶有 EcoRⅡ(↓CCWGG)。大多数情况下,其同裂酶 BstNⅠ(CC↓WGG)可避免这一影响,因为二者识别序列虽然相同,但切点不同。受此甲基化酶影响的酶还有 Acc65Ⅰ、 AlwNⅠ、 ApaⅠ、EcoRⅡ 和 EaeⅠ 等。不受此甲基化影响酶有 BanⅡ、 Bg1Ⅰ、 BstNⅠ、 KpnⅠ 和 NarⅠ 等。(3).EcoKⅠ 甲基化酶EcoKⅠ 甲基化酶的识别位点少,识别 AAC(N)6GTGC 和 GCAC(N)6GTT 序列中 A 的 N6 位置。但因为识别位点少(1/8kb),所以研究较少。(4).SssⅠ 甲基化酶SssⅠ 甲基化酶来自原核生物 Spiroplasma ,可使 CG 序列中的 C 在 C5 位置上甲基化。甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化链(新合成链)的 DNA 链。 SssⅠ 甲基化的 DNA 受 E.coli 中 mcrA、 mcrBC、 mrr 系统的限制。许多酶对此甲基化敏感,如 AatⅡ、 ClaⅠ、 XhoⅠ、 SalⅠ 等,也有不敏感的,如 BamHⅠ、 EcoRⅠ、 SphⅠ 和 KpnⅠ 。2)依赖于甲基化的限制系统E.coli 中至少有 3 种依赖于甲基化的限制系统 mcrA、 mcrBC 和 mrr ,它们识别的序列各不相同,但只识别经过甲基化的序列,都限制由 CpG 甲基化酶(M SssⅠ)作用的 DNA (限制即消化降解)。 Mrr 限制 m6A ; McrA 限制 HpaⅡ 甲基化修饰的位点; McrBC 切割两套半位点(G/A)mC ,这两套位点之间间隔 2kb ,最适为 55~103bp ,需 GTP ;大多数常用的 E.coli 都含这三个限制系统中的一个或几个,三个都不限制 Dcm 修饰的位点,Mrr不限制 dam、 EcoKⅠ、 EcoRⅠ 修饰的位点。3)甲基化对限制酶切的影响(1).修饰酶切位点HincⅡ 可识别四个位点(GTCGAC、 GTCAAC、 GTTGAC 和 GTTAAC),甲基化酶 M.TaqⅠ 可甲基化 TCGA 中的 A ,所以 M.TaqⅠ 处理 DNA 后, GTCGAC 将不受 HincⅡ 切割。M.MspⅠ 修饰的产物为 m5CCGG ,在 BamHⅠ 识别位点(GGATCC)前面如果为 CC 或后面为 GG ,那么经 M.MspⅠ 处理的 DNA (GGAT m5CCGG)对 BamHⅠ 不敏感(即抵抗切割)。构建 DNA 文库时,用 AluⅠ(AG↓CT) 和 HaeⅢ(GG↓CC) 部分消化基因组 DN

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